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INSTITUT FÜR
TOXIKOLOGIE

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WÄTJEN

GRADUIERTENKOLLEG
1427

GRK-PROJEKT-2

GRK-PROJEKT-6

TOXIKOLOGIE VON
NAHRUNGS-
ERGÄNZUNGSSTOFFEN

MYKOTOXINE

ANTI-TUMOR-
SUBSTANZEN AUS
TRAD. HEILPFLANZEN

ANTI-TUMOR-
SUBSTANZEN AUS
MARINEN
ORGANISMEN

SCHWERMETALL-
TOXIKOLOGIE

Toxikologische Aspekte von Schwermetallen am Beispiel von Cadmium

Cadmium ist ein stark toxisches und kanzerogenes Schwermetall, das ubiquitär in der Umwelt verbreitet ist. In der vorliegenden Arbeit wurden zelluläre Wirkmechanismen von Cadmium auf zwei Ebenen untersucht. Hinweise auf Mechanismen der kanzerogenen Wirkung konnten im ersten Teil der Arbeit gefunden werden, der sich mit der Wechselwirkung von Cadmium und intrazellulärer Signaltransduktion sowie der Cadmium-vermittelten Induktion von oxidativem Stress befasste. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Toxizität von Cadmium: Hier wurde die Cadmium-vermittelte Induktion von Apoptose untersucht und auf mögliche Wirkmechanismen hin überprüft.

In dieser Arbeit wurde zunächst die Cadmiumtoxizität in acht verschiedenen Zellinien untersucht, wobei z.T. große Unterschiede in der Sensitivität festgestellt wurden: Ratten C6‑Gliomazellen waren sehr sensitiv gegenüber einer Cadmiumexposition und zeigten im Neutralrot-Test einen EC₅₀-Wert von 0,7 ± 0,1 µM CdCl₂, wohingegen humane A549-Adenocarcinomazellen mit einem EC₅₀-Wert von 164 ± 13,2 µM CdCl₂ sehr resistent gegenüber einer Cadmiumexposition waren. 

Ein zellulärer Wirkmechanismus für Cadmium ist ein Eingreifen in intrazelluläre Signaltransduktionswege. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass Cadmium Hormon-induzierte Calciumsignale hemmt und eine cGMP/cAMP-Phosphodiesterase inhibiert (IC₅₀: 6 ± 0,7 µM CdCl₂). Diese Enzyminhibition verursachte einen Anstieg der intrazellulären cGMP-Konzentration, was zu einer veränderten Genexpresssion führen kann. Ein zweiter Wirkmechanismus ist die Induktion von oxidativem Stress durch Cadmium. Eine direkte Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies durch Cadmium konnte bei Kurzzeitexposition (bis 3 h) nicht nachgewiesen werden, es wurde hingegen nach 24 h ein Rückgang an freien SH-Gruppen und ein Anstieg an oxidativen DNA-Schäden gefunden. Eine Inkubation mit 5 µM CdCl₂ für 24 h verursachte in C6‑Zellen einen sechsfachen Anstieg der oxidativen DNA-Schäden von 1015 ± 402 Schäden (Basalwert) auf 6067 ± 601 Fpg-sensitive DNA-Läsionen pro Zelle. In PC12-Zellen verursachte eine Inkubation mit 5 µM CdCl₂ einen Anstieg der DNA-Schäden um den Faktor drei.

Der Cadmium-vermittelte Zelltod wurde in einigen der untersuchten Zellinien (C6-Gliomazellen, E367-Neuroblastomazellen und NIH3T3-Fibroblasten) über die Induktion von Apoptose ausgelöst. Dieser Prozess wurde in Ratten C6-Gliomazellen weiter untersucht. Es wurde eine apoptotische Fragmentierung der DNA gefunden, nachgewiesen als „DNA-Leiter“ im Agarosegel. Die Ausbildung der Leiter erfolgte 40 h nach der Applikation von CdCl₂, es konnte eine konzentrationsabhängige Induktion ab 2 µM CdCl₂ bis zu einem Maximum bei 75-100 µM CdCl₂ beobachtet werden, danach erfolgte aufgrund nekrotischer Prozesse ein Rückgang in der Ausbildung der Leiter. Im Fluoreszenzmikroskop wurde die Apoptose weiter analysiert: Nach 48 h kam es zu einer Chromatinkondensation und einer Fragmentierung der Zellkerne, weiter wurde eine Exposition von Phosphatidylserin nachgewiesen. Im Verlauf der Cadmium-induzierten Apoptose kam es zu einem Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials und einer Aktivierung der Caspase 9. Die Ausbildung der Cadmium-induzierten DNA-Leiter war ATP-abhängig und konnte mit Cycloheximid, einem Proteinbiosyntheseinhibitor, blockiert werden. Die Ausbildung der DNA-Leiter in C6-Gliomazellen war spezifisch für Cadmium, andere toxische Schwermetallionen wie Hg²⁺, Pb²⁺ oder Co²⁺ zeigten keine Apoptosekennzeichen. Nur eine Inkubation mit ZnCl₂ (ab 150 µM) führte, ebenso wie Cadmium, zur Ausbildung einer DNA-Leiter.

Untersuchungen zur Beteiligung von reaktiven Sauerstoffspezies an der Cadmium-induzierten Apoptose ergaben keine Hinweise: Die Cadmium-induzierte DNA-Leiter konnte durch Gabe von Antioxidanzien (Ascorbinsäure, a-Tocopherol) nicht inhibiert werden. Wasserstoffperoxid ist in C6-Gliomazellen ebenfalls ein Induktor des programmierten Zelltodes: Eine oligonukleosomale DNA-Fragmentation konnte ab 250 µM H₂O₂ (24 h) beobachtet werden. Es traten jedoch bei einer Ko-Applikation von Cadmium und H₂O₂ keine synergistischen bzw. additiven Effekte auf.

In weiteren Experimenten wurden Effekte von diversen Inhibitoren/Aktivatoren intrazellulärer Signalwege auf die Cadmium-induzierte DNA-Leiter in C6-Zellen untersucht. Es fanden sich verstärkende Effekte bei einer Ko-Applikation von Calcium-Modulatoren wie dem Calciumionophor A23187. Modulatoren einiger zentraler Signalwege wie des PKC- oder PKA-vermittelten Signalwegs zeigten keinen Effekt auf die Cadmium-induzierte apoptotische DNA-Fragmentierung. Aurintricarbonsäure (Aktivator der MAPK-Kaskade) und niedrige Konzentrationen des Ca²⁺-Chelators 5F-BAPTA/AM zeigten protektive Effekte auf die Cadmium-induzierte DNA-Fragmentierung. Das essentielle Metall Zink schützte vor einer Cadmium-induzierten Apoptose: Durch eine Ko-Inkubation mit ZnCl₂ (bis 50 µM) kam es in C6-Gliomazellen zu einer Reduktion der Cadmium-induzierten DNA-Fragmentation.

Arbeitsgruppe Prof. Detmar Beyersmann, Universität Bremen